Kap.
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9:_Inhibitoren,_IC50_&_Ki,_Hillkoeffizient
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Inhalt
Arten der Inhibition
Parameter zur Beschreibung einer Inhibition
unvollständige Hemmung
IC50
Inhibitionskonstante Ki, Cheng-Prusoff correction
Abhängigkeit der IC50 von der KD
Definition der Ki als Gleichgewichtskonstante
Einfluß eines kompetitiven Inhibitors auf die Sättigungsfunktion
Herleitung der Cheng-Prusoff correction
Sättigungs- und Hemmkurven linear und logarithmisch
Hill plot
Hill Koeffizient
Rechenbeispiel für nH = 3
Cheng-Prusoff correction für nH > 1
Um die Wechselwirkung einer Testsubstanz mit einer bestimmten Bindungsstelle zu untersuchen, bieten sich im Prinzip 2 Möglichkeiten an:
1.
Man kann die Testsubstanz selbst radioaktiv markieren (am bequemsten mit 3H), oder
2.
man überprüft, welchen Einfluß die Substanz auf die Bindung eines anderen Radioliganden hat.
Als Radioligand eignet sich eine Substanz erst bei Affinitätskonstanten von 100 nM und darunter. Bei schwächeren Affinitäten müßte man so hohe Konzentrationen einsetzen, daß der größte Teil der Ligandmoleküle unspezifisch binden würde. Als beste Strategie ist daher zunächst der 2. Weg zu empfehlen, und erst wenn man auf diese Weise einige hochaffine Substanzen identifizieren konnte, kann man daran gehen, eine von ihnen mit 3H zu markieren (bzw. markieren zu lassen).
Die Verfügbarkeit einer direkt markierten Testsubstanz bietet allerdings einen großen Vorteil: Man braucht nicht zu wissen, an welche Bindungsstelle die Substanz bindet. Stellt man hochaffine Bindung fest, kann man versuchen, die Bindungsstelle pharmakologisch zu charakterisieren, durch den Einsatz einer Palette nicht-markierter Liganden aller in Frage kommenden Bindungsstellen. Manchmal entdeckt man auf diese Weise auch neue Bindungsstellen. Diese Vorgangsweise wählt man oft bei Substanzen mit ausgeprägter physiologischen Wirkung (meist Agonisten), dessen Mechanismus man ergründen möchte. Es war z.B. selbstverständlich, stark excitatorisch wirkende Substanzen radioaktiv zu markieren ([3H]Kainsäure, [3H]AMPA, [3H]Glutaminsäure). Auch Morphin und Nicotin wurden selbstverständlich mit 3H markiert und erfolgreich zur Charakterisierung von Bindungsstellen eingesetzt.
Sucht man nach neuen Liganden für einen bestimmten Rezeptor, so setzt man nur einen oder 2 für diesen Rezeptor beschriebene Radioliganden ein und überprüft, ob die Testsubstanzen die Bindung des Radioliganden hemmen. Stellt man eine Hemmung fest, so ist das allein noch kein Beweis dafür, daß die Testsubstanz an dieselbe Bindungsstelle bindet wie der Radioligand. Für eine Hemmung gibt es mehrere Erklärungsmöglichkeiten:
1.
Die Testsubstanz bindet an dieselbe Bindungsstelle wie der Radioligand: kompetitive Hemmung.
2.
Die Testsubstanz bindet an eine andere Stelle des Rezeptors, führt zu einer Konformationsänderung und hemmt dadurch die Bindung des Radioliganden: nicht-kompetitive Hemmung (manchmal auch als allosterische Hemmung bezeichnet).
3.
Bei hoher Konzentration können viele Testsubstanzen auf Rezeptorproteine eine Detergenz-artige Wirkung haben (Veränderung der Konformation, meist irreversibel).
Eine kompetitive Hemmung läßt sich daran erkennen, daß das Ausmaß der Hemmung von der Konzentration des Radioliganden abhängt: je höher die Konzentration des Radioliganden, desto schwächer wirkt ein kompetitiver Antagonist.
Jede Hemmung, egal ob kompetitiv oder nicht-kompetitiv, ob Hemmung einer Bindung, einer Enzymaktivität oder irgendeines physiologischen Effektes, läßt sich immer durch 3 Größen charakterisieren:
1.
Das maximale Ausmaß der Hemmung
2.
Die Inhibitorkonzentration, die zu einer halbmaximalen Hemmung führt ('IC50')
3.
Die Steilheit der Hemmkurve ('Hill-Koeffizient', nH)
ad 1. Im häufigsten Fall können Inhibitoren bei ausreichender Konzentration vollständig hemmen. Mögliche Ursachen für unvollständige Hemmung:
Inhibitor bindet an anderer Stelle (allosterisch) und bewirkt dadurch eine schwächere Bindung; selbst eine Sättigung durch den Inhibitor kann die Bindung des Radioliganden nicht vollständig blockieren (ein Fall von nicht-kompetitiver Hemmung).
Der Radioligand bindet gleich gut an 2 verschiedene Bindungsstellen, der Inhibitor aber nur an eine von ihnen (kompetitive Hemmung an einer Rezeptor-Subpopulation).
Der Inhibitor führt zu einer Erhöhung der unspezifischen Bindung (leicht festzustellen).
ad 2. Im Idealfall gehorcht die Hemmung einer Bindung (oder irgend eines anderen Phänomens) durch einen Inhibitor (I), der bei ausreichend hoher Konzentration vollständig hemmt, einem einfachen Gesetz:
BL(I)
= BLo - BLo . I/(I + IC50)

= BLo . IC50/(IC50 + I)

I.........Inhibitorkonzentration
BLo...gebundener Radioligand in Abwesenheit des Inhibitors
Da die Stärke eines kompetitiven Inhibitors von der Konzentration des Radioliganden abhängt, muß gemeinsam mit der IC50 auch immer die Konzentration des Radioliganden angegeben werden, bei der die IC50 bestimmt wurde. Eine von der Radioligand-Konzentration unabhängige Größe zur Beschreibung der Stärke eines Inhibitors ist die Inhibitionskonstante (Ki):
Ki = IC50/(1 + L/KD)
Die Cheng-Prusoff-correction gibt die Beziehung zwischen Ki und IC50 an.
Je niedriger die Ligandkonzentration, desto ähnlicher wird die IC50 der Ki. Im Idealfall sollte die IC50 linear von der Ligandkonzentration abhängen:
IC50 = Ki + L . Ki/KD
Auf diese Weise lassen sich zugleich Ki des Inhibitors (Ordinatenabschnitt) und KD des Radioliganden (Abszissenabschnitt, negativ) bestimmen.
Für die Abbildung wurden Ki mit 1 µM und KD mit 3 nM angenommen.
Für die Bestimmung von Ki -Werten genügt es meistens, die IC50 bei einer einzigen Ligandkonzentration zu bestimmen. Die KD muß man nur hie und da mitbestimmen, um sicher zu gehen, daß die Versuchsbedingungen konstant sind.
Die Ki wird analog zur Gleichgewichtskonstanten eines Radioliganden (KD) definiert und ist die Gleichgewichtskonstante der als Dissoziation des Inhibitors von der Bindungsstelle geschrieben Reaktion

BI → B + I
Ki = [B] . [I]/ [BI]
Ligand und Inhibitor wetteifern gleichzeitig um dieselbe Bindungsstelle
Sättigung mit Ligand
Sättigung mit Inhibitor
BL → B + L BI → B + I
KD = B . L/BL
Ki = B . I/BI
Es gilt jederzeit B + BL + BI = BM . Substitution von B durch BM - BL - BI:
(1)
KD = (BM - BL - BI) . L/BL
(2)
Ki = (BM - BL - BI) . I/BI
gesucht: Abhängigkeit der Bindung BL von L und I
Strategie: BI aus Gleichung (2) berechnen, Ergebnis in Gleichung (1) einsetzen
Sättigung mit Ligand
Sättigung mit Inhibitor
BL = (BM - BI) . L/(KD + L)
BI = (BM - BL) . I/(Ki + I)
BL . (KD + L) 
= L . (BM - BI) 

= L . [BM - I . (BM - BL)/(Ki + I)]

= L . (BM . Ki + BM . I - BM . I + BL . I)/(Ki + I)
BL . (KD + L) . (Ki + I)
= L . BM . Ki + L . BL . I
BL . (KD . Ki + KD . I + L . Ki + L . I - L . I)
= L . BM . Ki
BL
= BM . L . Ki/[L . Ki + KD . (Ki + I)]

= BM . L/[L + KD . (1 + I/Ki)]
Herleitung der Cheng-Prusoff correction (Beziehung zwischen IC50 und Ki): 2 Gleichungen beschreiben die Abhängigkeit der Bindung (BL) von der Konzentration eines kompetitiven Inhibitors (I):
deskriptiv
analytisch
BL = BM . L/(L + KD) . IC50/(IC50 + I)
BL = BM . L/[L + KD . (1 + I/Ki)]
BM . L/(L + KD) = BLo
BM . L/(L + KD) . IC50/(IC50 + I)
 = BM . L/[L + KD . (1 + I/Ki)]
IC50 . [L + KD . (1 + I/Ki)]
= (L + KD) . (IC50 + I)
IC50 . (L + KD) + IC50 . KD . I/Ki
= IC50 . (L + KD) + I . (L + KD)
IC50 . KD . I
= Ki . I . (L + KD)
Ki
= IC50 . KD / (L + KD)

= IC50 / (1 + L/KD)
Cheng-Prusoff correction
ad 3. Beim Hill-Koeffizienten geht es um die Gestalt von Hemm- und Sättigungsfunktionen. Wir setzen uns daher parallel mit der Gestalt beider Funktionen auseinander.
Sättigung (Abhängigkeit von Ligandkonzentration)
Hemmung (Abhängigkeit von Inhibitorkonzentration)
BL(L) = BM . L/(L + KD)
BL(I) = BLo . IC50/(IC50 + I)
arithmetische Darstellung:
Es handelt sich in beiden Fällen um Hyperbeln; eine Asymptote ist die x-Achse bzw. eine Parallele zur x-Achse; die Anfangssteigung (bzw. das Anfangsgefälle) ist jeweils strichliert eingezeichnet und beträgt BM/KD bzw. - BLo/IC50.
logarithmische Darstellung:
Beide Kurven haben sigmoiden Charakter und einen Wendepunkt bei 50% maximaler Bindung. Der entsprechende Abszissenwert ist der Logarithmus von KD bzw von IC50.
Für beide Funktionen läßt sich eine linearisierte Darstellung erhalten:
Sättigung
Hemmung
BL . L + BL . KD = BM . L
BL . IC50 + BL . I = BLo . IC50
L . (BM - BL) = BL . KD
IC50 . (BLo - BL) = BL . I
BL/(BM - BL)  = L/KD
BL/(BLo - BL)  = IC50/I
log[BL/(BM - BL)] = - log KD + log L
log[BL/(BLo - BL)] = log IC50 - log I
linearisierte Darstellung, Hill-plot:
log KD bzw. log IC50 können als Abszissenabschnitt abgelesen werden.
In den linearisierten Darstellungen sollte die Steigung der Geraden eigentlich immer 1 bzw. (-1) sein (es steht kein Faktor vor log[L] bzw. vor log[I]). In der Praxis beobachtet man häufig Abweichungen von der Einheitssteigung, sowohl nach oben als auch nach unten. Eine realistischere Beschreibung der experimentellen Befunde wird durch Einführung eines Exponenten erzielt, des Hill-Koeffizienten, symbolisiert durch nH:
Sättigung
Hemmung
log[BL/(BM - BL)] = - nH . log KD + nH . log L
log[BL/(BLo - BL) = nH . log IC50 - nH . log I
Immer noch können log KD bzw. log IC50 als Abszissenabschnitt abgelesen werden (der Ordinatenabschnitt ist jetzt um den Faktor nH verändert!). Rückführung der linearisierten logarithmischen Darstellungen in die ursprünglichen Gleichungen unter Mitnahme der eben eingeführten Hill-Koeffizienten ergibt:
BL(L) = BM . LnH/(LnH + KDnH)
BL(I) = BLo . IC50nH/(IC50nH + InH)
Was bedeuten unterschiedliche Hill-Koeffizienten für die Gestalt von Hemmkurven ?
nH > 1: positive Kooperativität
Die Bindung eines Moleküls erleichtert die Bindung eines oder mehrerer weiterer Moleküle (steile Kurve).
nH< 1: negative Kooperativität
Die Bindung eines Moleküls erschwert die Bindung eines oder mehrerer weiterer Moleküle (flache Kurve); oder Bindung an 2 oder mehrere Bindungsstellen mit unterschiedlicher Affinität.
Konkretes Beispiel für positive Kooperativität: Die Bindung eines Radioligandmoleküls soll die Bindung weiterer stark erleichtern (Sättigungskurve mit nH > 1).
Bindung des 1. Moleküls
Bindung des 2. Moleküls
Bindung des 3. Moleküls
B + L → BL

BL + L → BL2

  BL2 + L → BL3
[B] . [L]/[BL]  = K1
[BL] . [L]/[BL2]  = K2
[BL2] . [L]/[BL3]  = K3
K1, K2, K3 sind die Dissoziationsgleichgewichtskonstanten (KD) der 3 Prozesse. Daraus folgt:
K1 . K2 . K3
= [B] . [L]3/[BL3]

= (BM - [BL] - [BL2] - [BL3]) . [L]3/[BL3]
Die Gleichung läßt sich vereinfachen, wenn [BL] und [BL2] << [BL3] sind, d.h. wenn die Bindung des ersten Ligandmoleküls die Bindung weiterer so stark begünstigt, daß im Gleichgewicht praktisch nur vollständig besetzte Bindungsstellen (in diesem Beispiel BL3) vorliegen (exakte Lösung: siehe TIPS 17, 403).
K1 . K2 . K3
 = (BM - [BL3]) . [L]3/[BL3]
[BL3]/(BM - [BL3])
 = [L]3/(K1 . K2 . K3)
log[BL3]/(BM - [BL3])
 = - 3 . log (K1 . K2 . K3)1/3 + 3 . log [L]
Für dieses spezielle Beispiel ergibt sich also ein nH = 3; die scheinbare Affinitätskonstante der Bindung entpuppt sich als geometrisches Mittel der Affinitätskonstanten der beteiligten Prozesse. Analoges läßt sich für beliebig viele gebundene Ligandmoleküle pro Bindungsstelle herleiten, immer unter der Vorraussetzung, daß inkomplett besetzte Bindungsstellen im Gleichgewicht keine Rolle spielen. Da diese Voraussetzung in der Praxis nie ganz erfüllt ist, ergeben sich nur selten wirklich ganzzahlige Hill-Koeffizienten (meistens liegen sie zwischen 0.7 und 1.4).
Vorsicht: Manche der hier vorgestellten mathematischen Zusammenhänge gelten nur für den einfachsten Fall (Hill-Koeffizient = 1). Cheng-Prusoff-correction für den Fall eines Agonisten mit positiv-cooperativer Stimulationskurve (nH > 1, TIPS 14, 110):
Ki = IC50/{[2 + (L/KD)nH]1/nH - 1}
nH ... Hillkoeffizient des Agonisten, mit dem der Inhibitor in Kompetition steht
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