8

Kap.

8:_Noradrenalin,_Dopamin_und_Serotonin

Inhalt

Noradrenalin, Dopamin, Serotonin
Prazosin, Rauwolscin
Idazoxan, RX 821002, 2-BFI, non-adrenoceptor-imidazoline(NAI)-Bindungsstelle
Dihydroalprenolol, Jodocyanopindolol diazirin, CGP 26505, ICI-118.551
Nisoxetin
Spiperon, Sulpirid
Clozapin, L-750.667
7-OH-DPAT, 5-OH-PIPAT
SCH 23390, SCH 23982
WIN 35428
Ketanserin
8-OH-DPAT, 8-OH-PIPAT
DOB, DOI
Granisetron, RS 23597-190
Citalopram

Alle 3 biogenen Amine stehen als ³H-Liganden hoher spezifischer Aktivität zur Verfügung:

[³H]Noradrenalin	natürliches Noradrenalin	[³H]Dopamin	[³H]Serotonin ([³H]5HT)

K_D (Razemat) 3-10 nM Filtrationstechnik selten verwendet	L (-) R-Isomer	K_D 2 nM Inkubation 30 min bei 25°C Filtrationstechnik	K_D 5 nM Inkubation 10-12 min bei 37°C Filtrationstechnik

Als physiologische Agonisten binden alle 3 Radioliganden an sämtliche Subtypen der entsprechenden Rezeptorart, allerdings mit unterschiedlicher Affinität; bei niedriger Konzentration (hoher Anteil an spezifischer Bindung) können manche Subtypen relativ selektiv markiert werden (Beispiel: 5HT₁-Rezeptoren mit [³H]5HT). Die Verwendung dieser Radioliganden geht mit einigen Problemen einher:

1.	Instabilität gegenüber membrangebundener Monoaminoxidase (MAO); Abhilfe: Zusatz eines MAO-Hemmer (z.B. 10 µM Pargyline).
2.	Empfindlichkeit gegenüber Luftsauerstoff; Bildung von ³H-markierten Oxidationsprodukten mit verwirrendem Bindungsverhalten (hochaffine Bindung, nicht hemmbar mit klassischen Amin-Antagonisten). Abhilfen: Zusatz von 0.5-5 mM Ascorbinsäure; unspezifische Bindung soll nicht mit Überschuß des unmarkierten Liganden, sondern mit anderer Substanz mit hoher Affinität zur Bindungsstelle bestimmt werden.
3.	'Bindung' durch Aufnahme in Membrankompartimente via uptake-carrier. Abhilfen: kein Na⁺ zusetzen (im Gegenteil, Zusatz von 1 mM EDTA), Zusatz eines spezifischen uptake-blockers (z.B. 1 mM Fluoxetine bei [³H]5HT-binding).

Die größte Bedeutung hat [³H]5HT, mit selektiv hoher Affinität zu 5HT₁-Rezeptoren (hohe Affinität für [³H]5HT war seinerzeit die Definition für 5HT₁-Rezeptoren). Man unterscheidet 5HT_1A-,5HT_1B- und 5HT_1D-Rezeptoren, mit einer Reihe selektiver Liganden.

Weitere Liganden für Noradrenalin-Bindungsstellen: 1946 unterscheidet Ahlquist zum ersten Mal zwischen alpha- und beta-Rezeptoren [TIPS 17,245; 1996]. Im Folgenden werden nur solche Radioliganden angeführt, die aus bestimmten Gründen wie Selektivität, niedrigem Preis oder Photoreaktivität besonders interessant erscheinen:

[³H]Prazosin		[¹²⁵J]Jodoarylazidoprazosin
	K_D = 0.1-0.5 nM Filtrationstechnik erlaubt Photoaffinitätsmarkierung

Prazosin ist ein Arzneimittel mit bekannt selektiver alpha₁-antagonistischer Wirkung.

[³H]Rauwolscine

Naturstoff, Diastereoisomer (a) des Yohimbine; beide sind alpha₂-Antagonisten, Rauwolscine ist selektiver und hat die stärkere Affinität, bindet aber auch an 5HT_1A-Rezeptoren.

K_D = 0.25-4 nM, Filtrationstechnik

Clonidin (Agonist)	[³H]Idazoxan (Antagonist)	[³H]RX 821002 (2- methoxy-Idazoxan)	2(2-Benzofuranyl)-2 -imidazolin (2-BFI)

Idazoxan und RX 821002 sind vom Clonidine abgeleitete alpha₂-Antagonisten (Bedingungen für [³H]Idazoxan: Inkubation 2 h bei 4°C, oder 30 min bei 21°C; Filtrationstechnik; K_D 0.8 nM). [³H]Idazoxan (nicht [³H]RX 821002) markiert zusätzlich eine 'non-adrenoceptor-imidazoline (NAI)'-Bindungsstelle (Bedeutung? Clonidin wirkt auf alpha₂- und auf NAI-Bindungsstellen). 2-BFI bindet nur noch an NAI-Bindungsstellen.

[³H]Dihydro- alprenolol	[¹²⁵J]Jodocyano- pindolol diazirin	[³H]CGP 26505	[³H]ICI-118.551 (±) (Tocris)

beta-Antagonist	beta-Antagonist	beta₁-Antagonist	beta₂-Antagonist

Alle Radioliganden besitzen hohe Affinität (K_D = 0.5-2 nM), geeignet für die Filtrationstechnik. Am preiswertesten ist das nicht-selektive Dihydroalprenolol; das Diazirin-Derivat des Pindolol (fetter Teil des Formelbildes, nicht-selektiv) erlaubt Photoaffinitätsmarkierung, bindet allerdings auch an 5HT_1A-Rezeptoren.

[³H]Nisoxetin

K_D = 0.8-4 nM

Inkubation 2h bei 4°C, in Gegenwart von 100-300 mM NaCl

Filtrationstechnik

Bindet selektiv an uptake-site für Noradrenalin

Weitere Radioliganden für Dopamin-Bindungsstellen:

[³H]Spiperon (= [³H]Spiroperidol)

vom Haloperidol abgeleitet:

K_D = 0.1-2 nM

Inkubation 1 h bei 20°C

oder 30 min bei 37°C

Filtrationstechnik

Bindet an D₂-Rezeptoren, aber mit gleicher Affinität auch an 5HT₂-Rezeptoren; selektive Markierung von D₂-Rezeptoren möglich bei Zusatz eines nicht-markierten 5HT₂-Liganden (z.B. Ketanserin). [³H]Spiperon ist der preiswerteste und am häufigsten eingesetzte Radioligand für D₂-Bindungsstellen; wird auch mit ¹²⁵J markiert angeboten (anstelle von F). Über den Einsatz als Antipsychotika, siehe Ian Chovil's homepage.

[³H]Sulpirid ähnlich: [³H]Racloprid

K_D =1-2 nM; die besten Resultate werden mit 120 mM NaCl erhalten; Filtrationstechnik.

Bindet nur an D₂-Rezeptoren (nicht an 5HT₂-Rezeptoren),

ist aber doppelt so teuer wie [³H]Spiperon.

[³H]Clozapin	D₄-Antagonisten	[¹²⁵J]L-750.667
	Clozapin wirkt antipsychotisch ohne extrapyramidale Nebenwirkungen K_D 9 nM, Filtrationstechnik; Selektivität gering (gegenüber D₂ < 10-fach). L-750.667 wesentlich potenter (K_D 0.1 nM) und selektiver (> 1000-fach). Keine therapeutische Wirkung.

R(+)[³H]7-OH-DPAT (Dipropylaminotetralin)	[³H]5-OH-PIPAT (Propyl-Iodo-Propenyl-AT)	[³H]PD 128907 Amersham / Tocris
			K_D = 0.5 - 6 nM Filtrationstechnik

Selektive D₃-Agonisten (7-OH-DPAT verliert Selektivität in Anwesenheit von 10 mM MgCl₂, EJP 272, R1); andererseits verhindert die Anwesenheit von Gpp(NH)p and NaCl die zusätzliche Bindung an 5HT_1A und D₂ Rezeptoren (Burris et al. 1994, JPET 268:935). D₃-Rezeptoren sind - zumindest in bestimmten Hirnregionen - präsynaptische Dopamin-Autorezeptoren. 5-OH-PIPAT: siehe Vessotskie et al. (1997) Brain Res. 778, 89; ähnliche Eigenschaften: 7-OH-PIPAT.

[³H]SCH 23390 (±)	[¹²⁵J]SCH 23982 (+)	(Benzazepine)
		K_D < 1 nM Filtrationstechnik

Selektive D₁-Antagonisten; binden auch an 5HT₂-Rezeptoren. Über D₁-Rezeptoren stimuliert Dopamin die Bildung von cAMP.

[³H]WIN 35428	ein Analog des Cocain:
		K_D 8 nM Inkubation 1 h bei 4°C 100-300 mM NaCl Filtrationstechnik

Bindet an uptake-sites für Dopamin.

Weitere Radioliganden für Serotonin-Bindungsstellen:

[³H]Ketanserin

K_D 1 nM

Inkubation 1 h bei 23°C

Filtrationstechnik

Klassischer 5HT₂-Antagonist; nicht billig; in Gegenwart von 1 µM des selektiven D₂-Antagonisten Sulpirid markiert das wesentlich billigere [³H]Spiperon ebenfalls selektiv 5HT₂-Bindungsstellen.Bei der Membran-Präparation darf kein Detergens verwendet werden, da sonst die Bindung verloren geht.

(±)[³H]8-OH-DPAT	R[¹²⁵J]8-OH-PIPAT
		8-OH-DiPropylAminoTetralin ist ein selektiver Agonist für 5HT_1A-Rezeptoren; das ¹²⁵J-markierte (R)-Propyl- IodoPropenylAmino-Tetralin (Doppelbindung!) bindet stärker (K_D = 0.1 nM; Chirality 7, 452; 1995) als das ³H-markierte Razemat (K_D = 6 nM).

5HT_1A-Rezeptoren hemmen die Ausschüttung von 5HT (hemmen die Bildung von cAMP).

4-Br- & 4-J-2,5-Dimethoxyphenyl-2-propanamin (DOB & DOI)

5HT_2A-Agonisten, Liganden für high affinity state des Rezeptors

X = Br: [³H]DOB; X = J: [³H]DOI

Amphetamin-Derivate (DOB: DiOxyBrom; DOI: DiOxyJod)

Sehr potente Halluzinogene

[³H]BRL 43694, Granisetron	[³H]RS 23597-190

K_D 1.7 nM selektiv für 5HT₃-Rezeptoren die einzigen ionotropen Rezeptoren für Serotonin (alle anderen mit G-Protein gekoppelt)	K_D = 25 - 100 pM selektiv für 5HT₄-Rezeptoren (metabotroper Rezeptor, hohe Affinität von 5HT selbst; cAMP); bindet auch an Sigma-Bindungsstellen (sigma₁, 4 nM)

[³H]Citalopram

K_D 0.8 nM

Filtrationstechnik

Antidepressivum, hochselektiver 5HT-uptake blocker

Radioligand für 5HT-uptake sites

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