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Kap.

2:_Praktische_Methoden:_Überblick

Gel-Filtration
Aktivkohle-Adsorption
Präzipitation
Adsorption an Glasfiberfilter
Filtration über Glasfiberfilter
Zentrifugation
Dünnschnittautoradiographie
Zubereitung partikulärer Präparationen

Präparation einer synaptosomalen Fraktion

Es gibt prinzipiell 2 unterschiedliche Strategien:

1. Qualitativer Nachweis einer Bindungsstelle, z.B. mittels immunologischer Verfahren. Dazu braucht man natürlich einen Antikörper gegen das Bindungsprotein. Die Wahrscheinlichkeit, daß der Antikörper mit der pharmakologisch relevanten Ligandbindungsstelle reagiert, ist gering, sodaß man aus solchen Experimenten meistens nichts über die Art der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung erfährt.

2. Quantitative Messung der Menge an Ligand-Rezeptor-Komplexen. Dazu braucht man einen markierten hochaffinen Liganden und ein Verfahren, gebundenen und nicht gebundenen Liganden voneinander zu trennen.

Im Folgenden werden Methoden vorgestellt, die bei der Verfolgung der 2. Strategie Anwendung finden. Dabei sollen die Komponenten einer einfachen Reaktion quantitativ erfaßt werden:

B + L* → BL*	B ...... unbesetzte Bindungsstelle
	L* .... freier, markierter Ligand
	BL* ...Ligand-Rezeptor-Komplex

Alle verwendeten Verfahren stehen vor dem Problem, den Komplex aus Bindungsstelle und markiertem Liganden vor dem Hintergrund des freien markierten Liganden zu bestimmen. Da beide gleich markiert sind, müssen sie voneinander getrennt werden. Dafür kommen alle biochemischen Techniken in Frage, die rasch niedermolekulare von hochmolekularen Molekülen bzw. Zellfragmenten trennen können. Durch die Trennung der Komponenten voneinander wird jedoch das Gleichgewicht gestört, mit der Konsequenz daß die Werte verfälscht werden, wenn der gestörte Zustand zu lange anhält. Deshalb muß die Trennung möglichst rasch erfolgen.

Das einzige Verfahren, daß die exakte Bestimmung der Konzentrationen aller miteinander im Gleichgewicht stehenden Komponenten erlaubt, ohne das Gleichgewicht zu stören, ist die

Gleichgewichtsdialyse

Nur die niedermolekularen Ligandmoleküle (L*) können die semipermeable Membran durchdringen und erreichen schließlich innen und außen die gleiche Konzentration.

Die Aktivitäten L* und BL* + L* können direkt gemessen werden, ohne das Gleichgewicht zu stören. Bei besonders schwachen Bindungen (rasche Dissoziation) die einzige praktikable Methode.

Nachteile:	Immer gilt: L* >> BL; daher ergibt sich BL als Differenz zweier annähernd gleich großer Zahlen (ungenau)
	Umständliches Verfahren, erlaubt keine große Anzahl von gleichzeitigen Bestimmungen
	Große Oberflächen, oft Probleme mit Adsorption des Liganden oder der Bindungsstelle an Dialysemembran oder Gefäßwand

Alle übrigen Methoden arbeiten außerhalb des Gleichgewichts. Die Phase des Ungleichgewichts dauert je nach Methode Sekunden bis Minuten. Bei hochaffinen Bindungen spielen derart kurze Zeiträume des Ungleichgewichts keine Rolle, da die Assoziations- und Dissoziationsprozesse äußerst langsam ablaufen (oft über Stunden).

Die Gleichgewichtsdialyse läßt sich bei gelösten (z.B. Steroidrezeptor; solubilisierter Rezeptor) und bei partikulären Bindungsstellen (Membranpräparation) anwenden. Die übrigen Verfahren (Nicht-Gleichgewichtsverfahren) eignen sich jeweils entweder für die eine oder die andere Form von Bindungsstellen.

Nicht-Gleichgewichtsverfahren für Bindungsstellen in Lösung

Man macht sich zunutze

# das stark unterschiedliche Molekulargewicht von Ligand und Ligand-Rezeptor-Komplex,

# Unterschiede in der Löslichkeit, oder

# unterschiedliche Adsorptionseigenschaften.

Gel-Filtration

Säulenchromatographie mittels Sephadex G50

Es genügt ein Gelvolumen von 2 ml; nach Einstellung des Gleichgewichts wird die Mischung aus Ligand und Ligand-Rezeptor-Komplex aufgetragen und eluiert. Der hochmolekulare Komplex eluiert VOR dem freien Liganden.

Aktivkohle-Adsorption

Die Trennung beruht ebenfalls auf unterschiedlichem Molekulargewicht. Im Herstellungsprozeß der Aktivkohle entstehen durch die Einwirkung von heißem Dampf winzige Poren (< 1 nm), in denen kleine Moleküle gut haften; große Moleküle werden nicht absorbiert. Vorgangsweise: Nach Einstellung des Gleichgewichts Zugabe einer eiskalten Aktivkohle-Suspension und sofortige Zentrifugation. Der freie Ligand wird praktisch sofort gebunden und dadurch dem Gleichgewicht entzogen ® Ligand-Rezeptor-Komplex beginnt zu zerfallen (man muß rasch arbeiten!).

Präzipization

Die klassischen Methoden der Proteinfällung werden kaum eingesetzt (Ammonsulfat, Zinksulfat). Übliche Methode: Fällung mit 10 - 15% Polyethylenglykol (PEG) mit anschließender Filtration über Zelluloseacetat-Filter. Üblicher Polymerisierungsgrad von PEG: Molekulargewicht 6.000 - 8.000. Als Carrier wird 1 mg/ml -Globulin zugesetzt. Probleme kann es bei Peptidliganden ab gewissen Kettenlängen geben (Mitfällung; z.B. Insulin, Glucagon). Die Fällung benötigt 10 - 20 min, die Vakuum-Filtration der viskosen Mischung dauert ziemlich lange; dennoch scheint diese lange Zeit des Nicht-Gleichgewichts nur wenig Probleme zu machen (langsame Diffusionsgeschwindigkeiten im zähen Medium).

Adsorbtion an Glasfiberfilter

Glasfiberfilter stellen eine anionische Silikatmatrix dar, an der positiv geladene Moleküle gut adsorbiert werden. Rezeptorproteine sind jedoch selbst meistens Polyanionen, mit einem isoelektrischen Punkt im schwach sauren Bereich (4.4 - 6.3[A1-Rez., FASEB 5, 2673]), sodaß sie nur schlecht binden würden. Sättigt man jedoch die Silikatmatrix zuvor mit einem Polykation, so kehrt sich dadurch der Charakter der Matrix um, und die meisten Rezeptorproteine werden dann sehr gut gebunden. Das Verfahren eignet sich gut für basische oder neutrale Liganden, nicht für saure (hoher background). Vorbehandlung der Glasfiberfilter: 1 h 0.3% Polyethylenimin (PEI). Diese Technik wurde unter anderen bereits erfolgreich für solubilisierte muskarinische und NMDA-Rezeptoren eingesetzt.

Nicht-Gleichgewichtsverfahren für partikuläre Bindungsstellen

Suspendierte partikuläre Bindungsstellen können natürlich zentrifugiert oder filtriert werden. Bei Bindung an ganze Gewebsschnitte gestaltet sich die Entfernung des ungebundenen Radioliganden noch einfacher. Experimentelle Details zu diesen Techniken werden später gebracht (siehe Kapitel 5), hier seien zunächst nur die wichtigsten Vor- und Nachteile genannt.

Filtration über Glasfiberfilter

Das mit Abstand am häufigsten eingesetzte Verfahren; eignet sich nur für hochaffine Liganden (K_D < 10 nM), denn meistens bedeutet hohe Affinität auch langsame Dissoziation des Ligand-Rezeptor-Komplexes. Einfach und rasch durchzuführen, für hohen Probendurchsatz automatisierbar. Probleme bei hydrophilen Liganden mit geringer Rezeptordichte wegen einer relativ hohen unspezifische Bindung an die hydrophile Filtermatrix.

Zentrifugation

Verfahren der Wahl für hydrophile Liganden mit relativ schwacher Affinität. Erfordert den Einsatz von Röhrchen, die hohe Schwerefelder tolerieren (bis 40.000 x g) und direkt im Szintillationszähler gezählt werden können. Etwas zeitaufwendiger als die Filtrationstechnik, nicht automatisierbar. Probleme kann es mit lipophilen Radioliganden geben, wenn sie stark an Kunststoffe binden (Vorversuche mit verschiedenen Röhrchen).

Dünnschnitt-Autoradiographie

Erfordert den Einsatz eines Mikrotoms zur Anfertigung der Schnitte (5 - 20 µm). Sehr vielseitige Methode, praktisch auf alle Radioliganden anwendbar. Bei Verwendung eines Densitometers mit angeschlossenem Computer können die Autoradiogramme exakt quantitativ ausgewertet werden. Hohe neuroanatomische Auflösung (< 0.1 mm). Will man die Möglichkeiten dieser Technik voll nützen, sind gewisse Investitionen erforderlich (Mikrotom, Densitometer, Computer incl. Programm). In den letzten Jahren lösen elektronische "screens" die traditionellen Filme ab.

Zubereitung partikulärer Rezeptorpräparationen

Für die Filtrations und die Zentrifugationstechnik (gelegentlich auch für das Dialyseverfahren) benötigt man eine feindisperse Suspension von Rezeptor-tragenden Zellmembranpartikeln. Zu diesem Zweck wird ein Gewebsstück, das die gesuchte Bindungsstelle enthält, homogenisiert, und aus dem Homogenat werden durch Zentrifugation die Zellmembranen gewonnen.

Ideal für die Homogenisation: ein nach Potter benannter Homogenisator aus Glas und Teflon. Ein runder Teflonkolben paßt genau in ein Glasrohr (5-50 ml, Spielraum 0.1-0.2 mm); Teflon und Glas schließen auch am Boden des Kolbens ab (kein Freiraum). Der Kolben wird mit der Hand oder mittels eines langsam drehenden Motors (5-10 Umdrehungen/sec) bewegt. Das Gewebsstück wird dabei vollständig desintegriert, bis in den subzellulären Bereich (Freisetzung der Zellorganellen). Manche Gewebe sind zu zäh für diese Methode und müssen mit dem Ultraturrax homogenisiert werden (Stab mit rasch drehenden Messern, weniger schonendes Verfahren). Für sehr kleine Gewebsstücke bietet sich die Homogenisation mittels Ultraschall an (Volumen 200 µl - 1 ml).

Als Homogenisationsmedium kommt alles in Frage, was die Rezeptorproteine nicht denaturiert (kein organisches LM; neutraler pH; möglichst niedrige Temperatur, jedoch keine Eiskristalle). Manche Bindungsstellen verlangen die Homogenisation in einem isotonen Medium, die meisten werden allerdings hypoton homogenisiert, um durch osmotischen Schock die vollständige Desintegration der Zellen zu erleichtern (man richte sich nach einer publizierten Arbeitsvorschrift).

Präparation der 'Gesamtmembranen': 10 min 35.000 x g genügt (ein Teil der Microsomen wird dabei nicht erfaßt, das spielt aber keine Rolle).

Präparation einer synaptosomalen Fraktion

Bei Homogenisation in einem isotonen Medium schließen sich die abgetrennten Nervenendigungen zu eigenständigen Membrankompartimenten ('Synaptosomen'). Sie verhalten sich gegenüber der Zentrifugalbeschleunigung so ähnlich wie Mitochondrien und können gemeinsam mit diesen als 'P2' gewonnen werden ('P1': alles was bei ca. 8.000 x g abzentrifugiert wird; was aus dem P1-Überstand bei ca. 17.000 x g abzentrifugiert wird, nennt man P2, für 'pellet # 2'). Synaptosomen können in einem Dichtegradienten von Mitochondrien (schwerer, enthalten DNA) abgetrennt und in verschiedene Fraktionen aufgetrennt werden. Für Bindungsanalysen werden die Synaptosomen zuletzt in einem hypotonem Medium lysiert (Freisetzung des löslichen Inhalts) um die synaptosomalen Membranen zu gewinnen. Ein vereinfachtes Verfahren verzichtet auf den Dichtegradienten und arbeitet mit der rohen P2-Fraktion (oft 'buffy coat membranes' genannt).

Auch hypoton behandelte Membranpartikel können niedermolekulare Substanzen festhalten (Glutaminsäure, Glycin, GABA, Peptide, Fettsäuren, ...). Sie müssen daher mehrmals 'gewaschen' werden (Resuspension in frischem Puffer, nochmalige Zentrifugation). Erwärmen auf 37°C (10-15 min) beschleunigt das Freisetzen niedermolekularer Substanzen; manchmal ist Zusatz von einem Detergens notwendig (0.02-0.08 % Triton X-100). Nach 3 - 5 maligem Waschen wird die Membransuspension aliquotiert und eingefroren (-80°C; nur wenige Bindungsstellen vertragen ein Einfrieren nicht). Vor dem Einsatz in einem Bindungsexperiment sollte eine aufgetaute Membransuspension noch einmal gewaschen werden, um Substanzen, die beim Frieren oder Auftauen freigesetzt wurden, zu entfernen.

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