1theo

Kap.

1: Theoretische Grundlagen

Begriffsbestimmungen
theoretische Untergrenze der Rezeptordichte
Bindungsstärke
Van't Hoff Gleichung
ionische Wechselwirkung
Wasserstoffbrücken
hydrophobe Wechselwirkung
Kation-p Wechselwirkung
Van der Waals Kräfte
Beispiele
Eigenschaften von ³H
spezifische Aktivität

Was sind Rezeptoren?

Makromoleküle oder Komplex aus mehreren Makromolekülen, meistens mit Zuckerresten, können in Membran eingelagert oder frei in Lösung sein; haben also vielfältige chemische Eigenschaften. Zum Rezeptor wird eine solche Struktur, wenn ihre Eigenschaften durch einen niedermolekularen Bindungspartner verändert werden können, mit charakteristischen physiologischen Konsequenzen.

Beispiele:

Bindungsstelle	physiologische Konsequenz
Lösliche Rezeptoren im Cytoplasma, für Steroidhormone wie Östradiol und Progesteron	Rezeptor-Steroid-Komplex wandert in den Zellkern und stimuliert die Transkription bestimmter DNA-Abschnitte (Änderung der Genexpression)
Rezeptoren auf der Oberfläche von Lymphozyten (T-Zell-Rezeptor): Erkennung von Fragmenten fremder Proteine	Immunantwort
Rezeptoren auf Muskelfasern für den Transmitter Acetylcholin, der von motorischen Nervenenden freigesetzt wird	Bindung des Transmitters führt zur Öffnung eines Na⁺-Kanals in der Muskelzelle (Depolarisation)

Rezeptoren sind immer Vermittler von Wirkungen. Daß diese Vermittler konkrete Moleküle sind wurde bereits in den 30er-Jahren postuliert; bis in die 70er-Jahre konnten Rezeptoren jedoch nur funktionell studiert werden, ein direkter biochemischer Nachweis gelang nicht. Heute gelingt er in der Bindungsstellenanalyse. Bindungsstellenanalysen sind einfacher durchzuführen als funktionelle Studien, man darf aber nie vergessen, daß eine Bindungsstelle erst durch ein funktionelles Korrelat zum Rezeptor wird. Beschränkt man sich auf die Messung der Bindung von Ligandmolekülen, sollte man nicht von Rezeptoren sprechen, sondern eben nur von Bindungsstellen.

Weitere Begriffe:

Ligand	(von ligare) Eine Substanz, die an ein biologisches Material gebunden wird; mit der Bezeichnung 'Ligand' ist noch nichts über eine mögliche Wirkung der Substanz ausgesagt.
Agonist	(von agere) Eine Substanz, die an ein biologisches Material bindet und mit dem Material etwas tut.
Antagonists	Eine Substanz, die an ein biologisches Material bindet und den Effekt eines Agonisten hemmt. Ein Antagonist hat für sich allein keine Wirkung.
Transmitter	(Übermittler) Ein physiologischer Agonist, der von einer Zelle 'auf Kommando' freigesetzt wird und in unmittelbarer Nachbarschaft wirkt.

Wieviele Rezeptoren kann man in einem biologischen Material erwarten?

Rezeptormoleküle sind äußerst aufwendige biologische Produkte (einige 100 bis über 1000 Aminosäuren), werden von einer Zelle so sparsam wie möglich hergestellt. Im Extremfall sollte es sogar möglich sein, daß Zellen eines Gewebsverbands auf eine niedermolekulare Substanz reagieren (Hormon, Transmitter), für die jede Zelle nur einen einzigen Rezeptor besitzt (die Bindung eines Liganden kann eine Kaskade von sich lawinenartig verstärkenden Effekten auslösen). Milchmädchenrechnung zur Abschätzung einer Untergrenze der Rezeptordichte:

Durchmesser einer Eukaryontenzelle	10 µm
Anzahl der Zellen pro Milligramm (= mm³)	1.000.000
Rezeptormoleküle pro Milligramm	1.000.000
1 Mol	6 . 10²³ Moleküle
0,001 fMol (10^-18 Mol)	600.000 Moleküle

1.000.000 Moleküle sind also nur etwas mehr als 0.001 fMol (1 femtomol = 10^-15 Mol); auch bei einem Molekulargewicht von 100.000 sind das nur 0.1 pg Protein pro Milligramm Gewebe. Die meisten heute bekannten Bindungsstellen zeigen um einen Faktor 10.000 – 100.000 höhere Gewebskonzentrationen (10 - 100 fMol/mg Gewebe); daraus kann man schließen, daß es von diesen Bindungsstellen wesentlich mehr als nur ein Molekül pro Zelle gibt. Aber sogar das ist immer noch sehr wenig für konventionelle analytische Nachweisverfahren.

Die Natur spart nicht nur bei den Rezeptormolekülen, sondern auch bei den niedermolekularen Bindungspartnern. Die meisten binden schon bei Konzentrationen im nanomolaren Bereich (10^-9 Mol/Liter) an den Rezeptor, sodaß auch davon nur kleine Mengen synthetisiert werden müssen (hohe Affinität des Liganden zur Bindungsstelle). Die Bindung erfolgt nicht-kovalent und reversibel, durch:

1.	ionische Wechselwirkung
2.	Ausbildung von Wasserstoffbrücken
3.	hydrophobe Wechselwirkung
4.	Kation-pi Wechselwirkung
5.	Van-der-Waals-Kräfte

Die Bedeutung der Bindungsstärke soll an 2 Extrembeispielen erläutert werden:

1. Es gibt Liganden (Peptidhormone, Wachstumsfaktoren), die schon im picomolaren Bereich (10^-12 Mol/Liter) an einen Rezeptor binden; die Bindung ist dann so stark, daß sie praktisch irreversibel verläuft. Das gebundene Peptid wird - gemeinsam mit dem Rezeptor - in die Zelle internalisiert; führt zu einer langsam einsetzenden, aber lang anhaltenden Wirkung (über eine Änderung der Genexpression).

2. Das andere Extrem sind schwache Wechselwirkungen, die erst im mikromolaren Bereich (10^-6 Mol/Liter) auftreten. In diesem Fall ist die Bindung von nur geringer Selektivität, d.h. eine breite Palette von Molekülen kann die gleiche Wirkung auslösen. Alle Liganden zeigen schwache Bindung an vielerlei schwache Bindungsstellen, meist ohne jegliche physiologische Bedeutung (unspezifische Bindung).

Die meisten Wechselwirkungen zwischen physiologischen Liganden und Rezeptoren

# finden bei nano (10^-9) bis micromolaren (10^-6) Konzentrationen statt,

# verlaufen unter physiologischen Bedingungen rasch (im Millisekunden-Bereich), und

# die Wechselwirkung verläuft stereoselektiv (d.h. es gibt zumindest 3 Stellen des Liganden, die mit der Bindungsstelle in Kontakt treten.

Welcher Zusammenhang besteht zwischen Gleichgewichtskonstante und Energiebillanz (∆G_o)?

Gleichgewichtskonstante der Assoziation:

B + L → BL

K_A = [BL]/([B] . [L])

Van't Hoff-Gleichung:

ln K_A = -∆G_o/RT

∆ G_o = -2.303 . RT . log K_A

R = 1.987 cal/(Mol . °K) bzw. 8.314 J/(Mol . °K) [1 cal = 4.184 J]

Temperatur		kcal/Mol	kJ/Mol
0°C (273°K)	∆G_o =	-1.25 . log K_A	-5.23 . log K_A
20°C (293°K)	∆G_o =	-1.34 . log K_A	-5.61 . log K_A
37°C (310°K)	∆G_o =	-1.41 . log K_A	-5.90 . log K_A

In Worten ausgedrückt: Ändert sich die Energiebillanz einer Bindung um 1.34 kcal (5.61 kJ) pro Mol, so ändert sich die Gleichgewichtskonstante um einen Faktor 10 (bei 20°C). Die Gleichgewichtskonstanten für typische Ligand-Rezeptor-Assoziationen liegen zwischen 10⁺⁷ und 10⁺⁹ M^-1. Gebräuchlicher ist es, die Konstanten für die entsprechenden Dissoziationen anzugeben (K_D = 1/K_A); K_D-Werte liegen also meist zwischen 10^-7 und 10^-9 M. Man beachte, daß hier - nicht ganz korrekt - mit Logarithmen dimensionierter Größen umgegangen wird: K_D hat die Dimension einer Konzentration, K_A die einer reziproken Konzentration.

ln K_D = ∆G_o/RT

∆G_o = 2.303 . RT . log K_D

2.303 . RT (293 °K) = 1.336 kcal/Mol

		∆G_o (20°C)
K_A	K_D	kcal/Mol	kJ/Mol
10⁷ M^-1	10^-7 M	-9.4	-39.3
10⁸ M^-1	10^-8 M	-10.7	-44.8
10⁹ M^-1	10^-9 M	-12.0	-50.2

Die meisten K_D-Werte liegen zwischen 1 und 100 nM; Schlußfolgerung: Bei der Bildung eines Ligand-Rezeptorkomplexes nimmt die freie Energie G_o meistens um 9 bis 12 kcal/Mol ab.

∆G_o = ∆H_o - T . ∆S_o/R	Gibbs-Helmholtz
ln K_D = ∆H_o/R . 1/T - ∆S_o/R	Van't Hoff-Plot

Über die Temperaturabhängigkeit der Dissoziations-Gleichgewichtskonstanten läßt sich erkennen, zu welchen Anteilen die Abnahme der Enthalpie (H_o) oder die Zunahme der Entropie (S_o) für eine Bindung verantwortlich ist. Zu diesem Zweck wird ln K_D gegen 1/T (T in °K) aufgetragen.

Worauf kann die Abnahme der freien Energie zurückgeführt werden? Was können die 5 genannten Wechselwirkungsarten beitragen?

ad 1, ionische Wechselwirkung

Weitreichende Anziehungskraft zweier entgegengesetzter Ladungen (e₁ und e₂), vermutlich für die erste Annäherung der Bindungspartner wichtig. Anziehungskraft proportional

e₁.e₂/(D.r²)

r ... Abstand zwischen den Ladungen

Ionische Wechselwirkung am stärksten im Vakuum (Dielektrizitätskonstante D = 1). In einem apolaren Lösungsmittel ist sie etwa halb so groß (Hexan: D = 1.9), im wässrigen Milieu sehr klein (H₂O: D = 78). Welche Rolle die ionische Wechselwirkung für eine bestimmte Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung spielt, ist schwer vorauszusagen, der Beitrag kann allerdings dann groß sein, wenn in der unmittelbaren Mikro-Umgebung der Bindungsstelle Wassermoleküle ausgeschlossen sind. Erfolgreicher empirischer Ansatz: "Gleitende" Konstante, mit Maximalwert (78) bei großer Distanz, und Minimalwert (1) bei Berührung (Ajay & Murcko 1995, J.Med.Chem. 38, pp 4961).

ad 2, Wasserstoffbrücken

Die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke (typische Länge 2.6 - 3.1 Å) führt je nach Orientierung zu einer Energieabnahme von 3 - 7 kcal/Mol. Theoretisch könnten also schon 2 solcher H-Brücken zu einer hochaffinen Bindung führen. In einem wässrigen Milieu sind allerdings alle Positionen der Bindungspartner, die H-Brücken eingehen könnten, durch Wassermoleküle besetzt; damit sich eine H-Brücke zwischen den Bindungspartnern ausbilden kann, müssen zuerst H-Brücken gelöst werden. Die Enthalpie-Billanz ∆Ho ist daher unergiebig, doch die Freisetzung von Wassermolekülen führt immer zu einer günstigen Entropie-Billanz T . ∆So (Gibbs-Helmholtz: ∆Go = ∆Ho - T . ∆So). Pro Mol Wasser werden allein dadurch 1.4 - 2.0 kcal frei:

B-H₂O + L-H₂O → B-L + 2 H₂O

nach Dunitz (1994) Science 264, 670

ad 3, hydrophobe Wechselwirkung

Bei hinreichend großer Annäherung werden die Bindungspartner von einer gemeinsamen Hydrathülle umgeben; zur Hydratisierung des Komplexes sind weniger Wassermoleküle erforderlich als zur Hydratisierung der einzelnen Komponenten. An hydrophoben Flächen nimmt Wasser eine stark geordnete Struktur an, um alle möglichen intermolekularen H-Brücken auszubilden. Zur günstigen Energiebillanz trägt daher bei einer 'hydrophoben WW' vorallem der entropische Term T . DSo bei. Empirische Faustregel: Energieänderung (in kcal/Mol) = -0.03 . F, wobei F = Fläche (in Å²), die durch die hydrophobe Wechselwirkung vor den Wassermolekülen verborgen wird. Beispiel Wechselwirkung von Phenylresten (Nature 248, 338; JMC 38, 4953; JRecSignTransdRes 17, 459):

Benzolring, Durchmesser	ca 6 Å
Fläche	ca 30 Å²
Ligand & Rezeptor	x 2 = 60 Å²
Ober- + Unterseite	x 2 = 120 Å²
frei werdende Energie	x 0.03 = 3.6 kcal/Mol

Bei diesem Beispiel werden für einen Phenylrest des Liganden 2 Phenylreste der Bindungsstelle benötigt; nicht immer kann dieses Maximalergebnis erzielt werden.

ad 4, Kation-pi Wechselwirkung

Überall dort, wo zu einer einfachen kovalenten Bindung zweier C-Atome (sprich: ein gemeinsames Elektronenpaar) ein weiterer Austausch von Elektronen dazukommt, ergeben sich Anknüpfungspunkte für positiv geladene Partner (Kationen). Das ist der Fall (A) bei Doppel- und Dreifachbindungen, und (B) bei Aromaten. In beiden Fällen bilden die zusätzlich gemeinsam "besessenen" Elektronen eine "Wolke" negativer Ladung rund um die primäre Bindung. Vor allem mit den aromatischen Aminosäurereste phe, tyr und trp treten positiv geladene funktionelle Gruppen (Aminogruppen) in Kontakt, wobei es zu Energieabnahmen zwischen 2 und 4 kcal/Mol kommen kann (siehe Zacharias & Dougherty 2002, TIPS 23/6, 281). Zahlreiche prominente Transmittersubstanzen gehen mit Rezeptoren diese Art der WW ein: Acetylcholin, GABA, Glutaminsäure, Glycin, 5-HT, Dopamine (also praktisch alle...).

ad 5, Van-der-Waals-Kräfte

Kommen einander 2 Atome auf 3 - 4 Å nahe, so führt das zu einer Energieabnahme von 0.5 - 1 kcal/Mol. Die Reichweite dieser Kraft ist gering (Abnahme mit r⁶), und auch zu große Nähe ist energetisch ungünstig (Abstoßung nimmt mit r¹² zu, sehr wenig Spielraum).

	anziehend	abstoßend
'Lennart-Jones-Potential':	- k₁ / r⁶	+ k₂ / r¹²

Die Wahrscheinlichkeit, daß eine größere Anzahl von Atomen des Liganden durch Zufall genau die passende Distanz zu Atomen der Bindungsstelle haben, ist äußerst gering. Hohe Selektivität und Stereospezifität gehen auf Van-der-Waals-Wechselwirkungen zurück.

pre-organisation: bestimmte Substituenten, die nicht selbst in WW mit der Bindungsstelle treten, bringen den Liganden in freier Lösung in eine für die Bindung günstige Konformation. Perola & Charifson (2004, JMC 47:2499) beschreiben bei 40% der von ihnen studierten Ligand/Protein-Wechselwirkungen strain energies von 5 bis 9 kcal/Mol, d.h. die Konformation eines gebundenen Liganden kann deutlich von seinem Energieminimum abweichen. Bei der Bindung wird also aus einer Vielzahl wechselnder Konformationen meistens eine eher unwahrscheinliche "herausgefangen" und in finalen Anpassungsschritten optimiert (induced fit).

Schon allein die physikochemischen Eigenschaften eines Liganden erlauben gewisse Vorhersagen bezüglich der zu erwartenden Wirkung. Hydrophobe Liganden fungieren meist als Antagonisten mit hoher Affinität (K_D 1 nM und darunter). Im Rahmen einer hydrophoben Wechselwirkung setzt die Bildung des Ligand/Rezeptor-Komplexes Wassermoleküle frei, wodurch das Wasser eine weniger geordnete Struktur annehmen kann (starke Zunahme der Entropie S, starke Abnahme der Energie, hohe Affinität). Die meisten Agonisten sind eher hydrophil; ihre Bindung allein kann zu keiner starken Abnahme des Gesamtenergieinhalts führen; sie bewirken aber eine Konformationsänderung eines größeren Bereiches des bindenden Makromoleküls. Im Zuge dieser Konformationsänderung kommt es zu einer Vielzahl kleiner Energieverluste, wodurch sich am Ende eine für die Stabilisierung der Bindung ausreichende Billanz ergeben kann.

Willkürliches Zahlenbeispiel für einen 'normalen' Liganden mit den Eigenschaften

# neutral

# 1 funktionelle Gruppe, die die Ausbildung einer H-Brücke erlaubt

# 1 hydrophobe Domäne

# optisch aktive Substanz.

Folgende Beiträge zur Bindungsstärke können erwartet werden (stark vereinfacht):

Ursache	Energieänderung
Ausbildung einer H-Brücke	-5 kcal/Mol
Verlust einer H-Brücke mit H₂O	+5 kcal/Mol
Freisetzung zweier H₂O-Moleküle	-3 kcal/Mol
hydrophobe WW über einen Phenylsubstituenten	-3 kcal/Mol
6 Atome mit Van-der-Waals-Kontakten	-4.7 kcal/Mol
Summe	-10.7 kcal/Mol

Bei diesem Beispiel würde das Ausmaß der Energieabnahme eine Affinitätskonstante von 10 nM voraussagen. Was passiert, wenn wir das andere Enantiomer einsetzen? Wenn wir annehmen, daß dann nicht mehr 6, sondern nur mehr 3 Van-der-Waals-Kontakte zustande kommen und sich der Beitrag aus dieser Wechselwirkung von -4.7 auf -2.4 kcal/Mol verändert, würde sich eine Summe von nur mehr -8.4 kcal/Mol ergeben; die Affinität wird dadurch auf 0.6 µM geschwächt, ein durchaus realistisches Resultat.

Grundvoraussetzungen für die analytische Erfassung einer Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung:

# Die Nachweistechnik muß empfindlich genug sein, um auch noch einige Femtomole des Ligand-Rezeptorkomplexes quantitativ exakt erfassen zu können.

# Um zu vermeiden, daß die geringe Menge an hochaffinen Bindungsstellen überlagert wird von einer zu starken unspezifischen Komponente, dürfen nur nanomolare Ligandkonzentrationen eingesetzt werden.

Diese Vorraussetzungen wurden erst durch die Synthese von radioaktiv markierten Liganden mit hoher spezifischer Aktivität erfüllt (70er Jahre). Das nach wie vor beliebteste Radionuklid für die Markierung von Liganden ist Tritium (³H).

Eigenschaften von ³H: Zerfallsart: ß-Zerfall

Halbwertszeit: 12.4 Jahre

maximale Emissionsenergie: 18.6 keV

maximale Reichweite in Wasser/ in Luft: 6 µm/ 6 mm

Reicht die spezifische Aktivität von ³H aus, um Femtomole eines Ligand-Rezeptorkomplexes registrierbar zu machen? Annahme: Ein Atom ³H pro Ligandmolekül

Zerfallsrate dA/dt = -k.A = -(ln2/t_1/2).A	A...Anzahl der aktiven Atomkerne
	k...Zerfallskonstante
	t_1/2...Halbwertszeit

Übliche Aktivitätseinheit für Zählgeräte: decays per minute (dpm, Zerfälle pro Minute).

Näherungsweise gilt für 1 Mol:

∆A/min (dpm) =	- (ln2/t_1/2) . 6,02 . 10²³	für 1 Mol
	- ln2 . 6,02 . 10²³/ (12,4 . 365 . 24 . 60)	t_1/2 in min
	- 64,1 . 10¹⁵	dpm pro Mol
	- 64,1	dpm pro fMol

64.1 dpm ist eine Aktivität, die sich gerade noch gut messen läßt - in den meisten Fällen beobachtet man mehrere fMole an Ligand-Rezeptor-Komplexen.

Übliche Einheit der spezifischen Aktivität bei Radioliganden:

Ci/mMol

oder

TBq/mMol

1 Ci ('Curie') =	3,7 . 10¹⁰ Bq	1 TBq = 10¹² Bq ('Bequerel') =	10¹² dps (decays per s)
=	2,22 . 10¹² dpm	=	60 . 10¹² dpm

ca. 27 Ci = 1 TBq

ca. 27 µCi = 1 MBq

64,1 . 10¹⁵ dpm/Mol = 64,1 . 10¹² dpm/mMol = 28,9 Ci/mMol = 1,07 TBq/mMol.

Die meisten ³H-markierten Radioliganden werden mit ungefähr dieser spezifischen Aktivität angeboten, also im Durchschnitt mit einem Atom ³H pro Molekül. Die höchsten angebotenen spezifischen ³H-Aktivitäten liegen bei ca. 100 Ci/mMol (3-4 ³H-Atome /Molekül).

Halbwertszeiten einiger für Radioliganden wichtiger Nuklide:

³H	12,4 Jahre
¹⁴C	5.730 Jahre
³⁵S	87,4 Tage
¹²⁵J	59,6 Tage

¹⁴C-markierte Substanzen eignen sich kaum als Radioliganden (t_1/2 462 x länger, daher 462 x schwächere spezifische Aktivität). Durch den Einbau von ³⁵S (t_1/2 87.4 d) oder ¹²⁵J (t_1/2 59.6 d) lassen sich wesentlich höhere spezifische Aktivitäten als mit ³H erzielen. Allerdings sind diese Atome nur in wenigen pharmakologisch interessanten Molekülen enthalten. Zusätzlicher Einbau von Jod ist möglich (vor allem bei Peptiden üblich), kann aber die Eigenschaften des Moleküls deutlich verändern.

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