Kap.
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9
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11:_Versuchsplanung_und_Auswertung
12
Inhalt
Wahl der Ligandkonzentrationen
Konzentrationerhöhung mit unmarkiertem Liganden
Schrittweise Auswertung
Umrechnung auf molare Einheiten
Graphische Darstellung nach Scatchard und nach Eadie & Hofstee
Zusammenhang mit anderen Linearisierungen: Hill, Lineweaver-Burk
Gegenüberstellung Sättigung : Reziprokdarstellung
Bereiche mit unvermeidlichen Meßfehlern
Nicht-lineare Reziprokdarstellung
Ligandverarmung & "positive Kooperativität"
Heterogenität & "negative Kooperativität"
Kurvenanpassung; nicht-lineare Eadie-Hofstee Funktion
Auswertung von Hemmkurven
flach versus biphasisch
Bestimmung von BM und KD eines Radioliganden
Zur exakten Ermittlung der Gleichgewichtsparameter einer Bindungsstelle sollte man 20 verschiedene Ligandkonzentrationen einsetzen, die sich über einen Konzentrationsbereich von 4 Zehnerpotenzen erstrecken. Nur so lassen sich Anomalien erkennen, wie z.B. positive oder negative Kooperativität oder Heterogenität der Bindungsstellen. Bei einer bereits gut charakterisierten Bindungsstelle sollte es jedoch genügen, mit 4-6 verschiedenen Ligandkonzentrationen den Konzentrationsbereich um die zu erwartenden Affinitätskonstante abzudecken. Vorausgesetzt, die Sättigungskurve verläuft nicht abnormal flach, kann mit einem Konzentrationsbereich von etwa 2 Zehnerpotenzen 10 - 90% Sättigung erzielt werden. Das genügt im Allgemeinen, um verläßliche Werte für BM und KD zu erhalten.
Richtlinien zur Wahl der Ligandkonzentrationen:
1. niedrigste und höchste Konzentration etwa um den Faktor 100 auseinander
2. die Ligandkonzentrationen sollen geometrisch (nicht arithmetisch) äquidistant liegen
3. sollen etwa symmetrisch um den zu erwartenden KD -Wert liegen
Beispiele:
Radioligand: [3H]Glycin [3H]Mk-801 [3H]Kainsäure
zu erwartende KD 40 - 80 nM 5 - 20 nM 0.7 - 1.5 nM
Ligandkonzentr. 10, 30, 100, 300 nM 1, 3, 10, 30, 100 nM 0.2, 0.6, 2, 6, 20 nM
Nur bei Konzentrationen im niedrigen nanomolaren Bereich setzt man den Radioliganden pur in verschiedenen Konzentrationen ein. Für höhere Konzentrationen setzt man nicht-markierten Liganden zu, denn
(1) sind einige 100 bis 2 000 dpm als Ergebnis genug; 
(2) spart man damit Geld; und
(3) senkt man das Kontaminationsrisiko.
Beispiel [3H]Glycin:

1. Konz. 2. Konz. 3. Konz. 4. Konz.
[3H-Glycin] 10 nM 10 nM 10 nM 10 nM
[1H-Glycin] - 20 nM 90 nM 290 nM
Gesamtkonzentration 10 nM 30 nM 100 nM 300 nM
spezifische Aktivität 22 Ci/mMol 7.3 Ci/mMol 2.2 Ci/mMol 0.73 Ci/mMol
Korrekturfaktor 1 3 10 30
Beispiel [3H]Mk-801:

1. Konz. 2. Konz. 3. Konz. 4. Konz. 5. Konz.
[3H-MK-801] 1 nM 3 nM 3 nM 3 nM 3 nM
[1H-MK-801] - - 7 nM 27 nM 97 nM
Gesamtkonzentration 1 nM 3 nM 10 nM 30 nM 100 nM
spezifische Aktivität 39 Ci/mMol 39 Ci/mMol 12 Ci/mMol 3.9 Ci/mMol 1.2 CimMol
Korrekturfaktor 1 1 3.33 10 33.3
Diese Strategie ist zulässig, weil 3H-markierte Liganden an die Bindungsstelle genauso binden wie nicht-markierte. Da man in erster Linie an der Bindung des Liganden interessiert ist - egal, ob markiert oder nicht - rechnet man die Bindung des Radioliganden unter Berücksichtigung der jeweiligen spezifischen Aktivität in molare Einheiten um.
Schrittweises Vorgehen bei der Auswertung:
1. Subtraktion der unspezifischen Bindung
2. Umrechnung auf einheitliche spezifische Aktivität (Multiplikation mit 'Korrekturfaktor')
3. Umrechnung auf molare Einheiten
4. Bezug auf Gewichtseinheit des Gewebes (abhängig von der Membranpräparation)
5. Graphische Darstellung und/oder Auswertung mittels Computerprogramm
 
Die unspezifische Bindung nimmt linear mit der Konzentration des Radioliganden zu und muß nur bei der höchsten Konzentration bestimmt werden (offener Kreis 1). Für andere Konzentrationen werden die Werte zwischen diesem einem Wert und dem Leerwert der Szintillationszählung (2) linear interpoliert. Der Leerwert muß unter den gleichen Bedingungen wie die Proben gemessen werden (gleiches Volumen an Szintillator, Filter, ...). Merke: Zusatz von 'kaltem' Liganden erhöht nicht die Konzentration des Radioliganden und damit auch nicht die unspezifische Bindung!
Gesamtbindung ('total binding')
minus unspezifische Bindung ('nonspecific binding')
= spezifische Bindung ('specific binding', 3 in der Abbildung)
Umrechnung auf molare Einheiten:
Aktivität/spezifische Aktivität (Aktivität/Mol) = Mol
 
Die spezifische Aktivität wird vom Erzeuger in
Ci/mMol
oder
TBq/mMol
(pCi/fMol)
  
(Bq/fMol)
angegeben.
Zur Erinnerung: 1 pCi = 2.22 dpm ('dpm' = decays per minute; siehe Kapitel 1).
Beispiel: Radioligand mit 30 Ci/mMol (1.11 TBq/mMol). Ein fMol würde einer Aktivität von 30 pCi (1.11 Bq) entsprechen, also 30 x 2.22 = 66.6 dpm. Die in dpm erhaltenen Resultate werden in fMole umgerechnet, indem man sie durch 66.6 dividiert.
Graphische Darstellung: Linearisierung nach Scatchard oder nach Eadie & Hofstee
Hypothetisches Experiment mit folgenden Ergebnissen (spezifische Bindung):
L (nM):
0.1
0.3
1
3
10
30
100
BL (fMol):
3.23
9.09
25
50
76.9
90.9
97.1
BL/L (µl-1):
32.3
30.3
25
16.7
7.69
3.03
0.97
Darstellung nach Scatchard: BL/L ('bound over free') gegen BL ('bound') aufgetragen
 Vertauschung der Achsen ergibt die 'Eadie-Hofstee'-Darstellung
BL/L = BM/KD - 1/KD . BL
BL = BM - KD . BL/L
Auswertung nach Scatchard:
# Schnittpunkt mit der Abscisse = BM
# Steigung = -1/KD
Auswertung nach Eadie & Hofstee:
# Schnittpunkt mit Ordinate = BM
# Steigung = -KD
Zusammenhang zwischen verschiedenen Lineardarstellungen der Sättigungsfunktion
BL = BM . L/(L+KD)
 Michaelis-Menthen
↓ x (L+KD)
BL . L + BL . KD = BM . L
BL/L = BM/KD - 1/KD . BL      Scatchard
↓ ÷ L
­

x ↔ y

BL + KD . BL/L = BM               →
BL = BM - KD . BL/L     Eadie-Hofstee
↓ ÷ BL
1 + KD . 1/L = BM/BL               →
       BM/BL - 1 = KD . 1/L
↓ ÷ BM
BL/(BM - BL) = 1/KD . L
1/BM + KD/BM . 1/L = 1/BL
1/BL = 1/BM + KD/BM . 1/L
Lineweaver-Burk
log [BL/(BM - BL)] = -log KD + log L
Hill (siehe Kap.9)
Die Darstellung nach Lineweaver & Burk (1/V gegen 1/S, in Bindungsversuchen 1/BL gegen 1/L) kommt nur in der Enzymkinetik zur Anwendung.
 
Sättigung
Reziprokdarstellung nach Eadie & Hofstee
Numerisch simulierte Sättigungsversuche. Allein aufgrund der Sättigungskurven (links) wäre es nicht möglich, BM und KD verläßlich abzuschätzen. Die reziprok transformierten Daten (rechts) sind dagegen problemlos auszuwerten. Die Beispiele zeigen auch, daß es für die Auswertung nicht hilfreich ist, L arithmetisch ansteigen zu lassen.
Fehlerbereiche:
Bei sehr niedrigen und bei sehr hohen Ligandkonzentrationen (L) sind Meßfehler unvermeidlich. Bei hohem L ist daran der hohe Anteil der unspezifischen Bindung schuld. Bei sehr niedrigem L bewegt man sich mit den Zählraten bereits in der Nähe des Geräte-Leerwertes. Die punktierten Begrenzungen geben an, in welchen Bereich 90% der Meßdaten fallen werden (Eadie- Hofstee- Darstellung).
Die Auswertung richtet sich nach dem ersten Eindruck, den die graphische Darstellung vermittelt. Streuen die Punkte nach Linearisierung augenscheinlich um eine Gerade, so berechnet man die Korrelationsgerade. Streuen die Punkte jedoch um eine gekrümmte Linie, so gibt es dafür mehrere Erklärungen:
1.
Experimentelles Artefakt (z.B. freie Ligandkonzentration sinkt ab, zu kurze Inkubationszeiten für die niedrigsten Ligandkonzentrationen, ...)
2. Bindung an 2 Populationen von Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität
3. Positive oder negative Kooperativität
Experimentelle Artefakte lassen sich durch eine geeignete Änderung der Vorgangsweise ausschalten. Schwieriger ist es, zwischen negativer Kooperativität und Heterogenität zu unterscheiden. Für die folgenden Beispiele wurde die Darstellung nach Eadie & Hofstee gewählt. Die unterbrochene Gerade deutet jeweils an, wie die Darstellung ohne die betreffende Anomalie aussehen würde.
Verarmung des Radioliganden wegen zu großer Menge an Membranen (Artefakt)
für die Abbildung wurde eine KD = 3 nM und eine BM = 100 fMole/mg Gewebe angenommen, aber statt 1 mg wurden 10 mg Gewebe pro ml eingesetzt.
positive Kooperativität
für die Abbildung wurde KD = 3 nM und nH = 1.1 angenommen.
Bindung an 2 Komponenten mit unterschiedlicher Affinität
für die Abbildung wurde für 80% der Bindungsstellen eine KD = 3 nM angenommen und für die restlichen 20% eine KD von 30 nM.
negative Kooperativität
für die Abbildung wurde KD = 3 nM und nH = 0.9 angenommen.
Resultate mit nicht-linearer Reziprok-Darstellung müssen durch Kurvenanpassung mittels Computerprogramm ausgewertet werden. Man geht dabei meistens direkt von den nicht-transformierten Sättigungsdaten aus und versucht, sie an folgende Funktionen anzupassen:
Hypothese
Funktion
2 verschiedene Bindungsstellen:
BL = B1 . L/(L + K1) + B2 . L/(L + K2)
negative Kooperativität:
BL = BM . LnH/(LnH + KDnH)
Im Falle 2er verschiedener Bindungsstellen bedeuten  B1 und B2 die jeweiligen BM-Werte und K1 und K2 die jeweiligen KD-Werte der beiden Bindungsstellen. Werte bei niedriger Ligandkonzentration müssen dabei stärker berücksichtigt werden als Werte bei hoher Ligandkonzentration; man braucht also eine gewichtete Kurvenanpassung. Korrekt - aber aufwändig - ist die Gewichtung jedes einzelnen Wertes mit seiner Standardabweichung (SD); zur Not läßt sich auch mit L gewichten, denn über einen weiten Bereich ist die SD proportional zu L. Aus diesem Grund kann die reziprok transformierte Darstellung ohne Gewichtung angepaßt werden. Die Eadie-Hofstee-Darstellung sieht bei Vorliegen von 2 verschiedenen Bindungskomponente folgendermaßen aus:
BL = 1/2 . [B1 + B2 - B/L . (K1 + K2) + {[B1 - B2 - B/L . (K1 - K2)]2 + 4 . B1 . B2}1/2]
Messung von IC50, Ki und nH - Werten
Bei einer Substanz, deren inhibitorische Potenz man bereits näherungsweise kennt, genügt meist der Einsatz von 4 - 6 Konzentrationen, die
1. einen Bereich von etwa 2 Zehnerpotenzen umspannen,
2. zueinander geometrisch äquidistant liegen;
3. gleichmäßig um die erwartete IC50 herum gruppiert sind.
Eine Testsubstanz, deren Potenz man nicht voraussagen kann, setzt man am besten bei 2 relativ hohen, weit auseinanderliegenden Konzentrationen ein (z.B. 1 und 100 µM); hemmt keine der beiden Konzentrationen die Bindung des Radioliganden, so kann man die Substanz als inaktiv ausscheiden. Erfolgt aber eine Hemmung, so hat man aufgrund der beiden Konzentrationen gleich einen Hinweis, in welchem Konzentrationsbereich die Hemmung am günstigsten zu untersuchen wäre.
Der erste Schritt bei der Auswertung einer Hemmkurve ist die graphische Darstellung im logarithmischen Maßstab, um sich einen groben Eindruck vom Resultat zu verschaffen.
Macht die Verdrängungskurve einen eher stufenförmigen Eindruck, so sollte man für die Kurvenanpassung besser eine biphasische Funktion wählen; die Hill-Koeffizienten setzt man in einem solchen Fall willkürlich gleich 1:
Verläuft die Kurve scheinbar gleichförmig, wählt man für die Kurvenanpassung eine monophasische Funktion mit variablem Hill-Koeffizienten:
BL = B1 . IC1/(IC1 + I) + B2 . IC2/(IC2 + I)
BL = Bo . IC50nH/(IC50nH + InH)
IC1 und IC2 sind die beiden vermuteten IC50-Werte, und B1 und B2 die entsprechenden Anteile. Hat man den Eindruck, daß eine der Verdrängungskomponenten eine abnorme Steigung aufweist, kann man natürlich auch mit variablen Hill-Koeffizienten arbeiten, allerdings braucht man für eine solche Anpassung eine größere Anzahl von Punkten (Faustregel: 2 Punkte pro Parameter; im konkreten Fall also 8 ohne, und 10 mit Berücksichtigung eines Hillkoeffizienten, und 12, wenn man beide bestimmen will).
Bei Verdrängungskurven, die abnorm flach verlaufen, ist es nicht immer leicht, sich für eine der beiden vorgeschlagenen Funktionen zu entscheiden (analog zur schwierigen Unterscheidung zwischen negativer Kooperativität und Heterogenität bei Sättigungsfunktionen, siehe oben):
Deutlich biphasischer Verlauf; die beiden Komponenten haben IC50-Werte von 2 und 2000 nM. Die strichlierte Funktion entspricht einer einheitlichen Komponente mit IC50 = 52 nM und nH = 0.34. In diesem Fall liegen die beiden Komponenten näher zueinander (2 und 200 nM). Fast genauso gut lassen sich die Punkte auch an eine einheitliche Funktion mit IC50 = 18 nM und nH = 0.51 anpassen.
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